产品说明：

     本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA 5’末端全长的试剂盒。使用RT-PCR方法扩增目的DNA时，一般很难得到全长的cDNA片段，在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列十分重要。RACE法能有效解决这一问题。Bioteke 5’-Full RACE Kit能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的5’末端的全长序列。本试剂盒通过RNA反转录酶与靶RNA的已知序列互补的引物引导合成第一链cDNA ，第一链cDNA的3’末端在通过末端转移酶使之同聚物加尾；这种合成的同聚物存在于mRNA 5’未知序列的上游并提供了一个引物结合位点，扩增反应的产物能克隆至T载体上。在进行试验时，应同时进行几个样品的反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。用于cDNA合成的溶液试剂尽可能的DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。客户需自备试剂无水乙醇，基因特异性引物，PCR用相关试剂。

 

注意事项：

◆ 进行5′RACE实验时，为提高RACE结果的可信度，应同时M-MLV（-）的负对照实验。M-MLV（-）即：5′RACE Adaptor连接反应后进行RT反应时不添加M-MLV，如果M-MLV（-）的负对照实验没有特异性扩增，说明5′RACE结果来源于mRNA。

◆ 同时进行几个样品的反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix），然后再分装到每个反应管中。

 

问题解答：

1．Total RNA使用量是否可以增减？

可以。Total RNA使用2μg 时扩增效果较好，1μg时扩增稍弱。推荐RNA模板使用量为2μg 。

2． RT-PCR反应时何时需要将RNA预变性？

RNA立体结构比较复杂，RNA不预变性时没有得到理想结果时需要将RNA预变性。

3． 5′RACE扩增的电泳结果出现多种条带，为什么？

原因可能是：扩增的基因为多基因家族的成员； 已知序列信息有限，导致PCR扩增特异性差；mRNA 5′端剪切、拼接方式不同。