产品说明:

         本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA 3′末端全长的试剂盒。对RNA结构进行分析时，一般先通过RT-PCR反应扩增目的区域，然后再对扩增出的目的DNA片段进行克隆、序列分析等。一般的RT-PCR反应很难得到全长的cDNA片段，而RACE法能有效地解决这一问题。Bioteke公司生产的3’RACE试剂盒能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的3′末端的全长序列。本试剂盒中含有完成3′-RACE操作的主要试剂。试剂盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNase H活性，大大增加了反转录性能。进行3′RACE 实验时，首先由Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）将mRNA反转录成cDNA，然后再使用Bioteke LA Taq，以反转录的cDNA为模板，进行套式PCR反应。3′RACE Adaptor作为反转录引物用于合成1st Strand cDNA；使用基因上游外侧特异性引物1和3′RACE Primer 1进行1st PCR反应。如果1st PCR反应未能得到目的产物，再使用基因上游内侧特异性引物2和3′RACE Primer 2进行2nd PCR反应。PCR产物可以直接进行DNA测序或TA克隆。

 

产品组成：

 

制品可用于20次反转录反应（约100次3′RACE PCR反应）

 

实验时需要自备的其他试剂：扩增目的DNA片段的上游特异性引物；PCR用DNA聚合酶。我们推荐使用Bioteke LA Taq，也可以根据实验需要选用其他PCR用DNA聚合酶。

 

试剂盒注意事项:

◆ 同时需要进行数次反转录反应或PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture等），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。

◆ 使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、RNase Inhibitor等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡，分取之前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。

 

问题解答

1. RT-PCR反应后，无PCR产物或出现Smear，怎么办？

此时请从提取的RNA样品的纯度和添加量、基因的表达丰度、基因的长度和GC含量、引物的设计情况、参考文献的可信度以及RT-PCR条件的设定等方面加以考虑。

2. PCR反应时，反转录反应液的使用量使用多少较为合适？

 反转录反应液的使用量可控制在1μl～10μl的范围。

3. 3′RACE PCR扩增产物经电泳分析后，有时为什么出现多条带现象？

可能是因为未知序列信息不清楚导致了非特异性扩增； 扩增的基因为多基因家族的成员；mRNA不同的拼接方式造成的。