一、试剂盒组成、储存、稳定性 试剂盒组成 保存 50 次 （DP6211） 100 次 （DP6213） 红细胞裂解液 室温 500 ml 1000ml 细胞核裂解液 室温 160 ml 320ml 蛋白沉淀液 室温 55 ml 110ml DNA 溶解液 室温 20 ml 40ml 蛋白酶 K （20mg/ml） （仅 II 型提供） -20℃ 20mg 冻干粉 20mgx2 冻干粉 凝固柱 室温 50 个 100 个 本试剂盒在室温储存 18 个月不影响使用效果。 注意事项 1． 环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃ 水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2． 蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在 37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不能 完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。 3． 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖 紧盖子。 二、原理简介 本试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组 DNA。首先红细胞 裂解液裂解去除不含 DNA 的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因 组 DNA, 然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组 DNA 通 过异丙醇沉淀并重溶解于 DNA 溶解液。 三、试剂盒特点 1． 从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。 2． 不需要使用有毒的苯酚等试剂。 3． 快速，简捷，适合同时提取多个样品。 4． 结果稳定，产量高（典型的产量 5ml 全血可提取出 75-250µg）， OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9，长度可高达 50Kb-150kb，可 直接用于构建文库，PCR，Southern-blot 和各种酶切反应。 四、注意事项（实验前必须首先阅读这部分！） 1． 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到10,000rpm，并配 备容纳50ml离心管转头的传统台式离心机。 2． 为便于运输。红细胞裂解液为 10×，使用时请稀释成 1×。用户需 自备异丙醇和 70％乙醇。 3． 典型的产量 5ml 全血可提取出 75-250µg 基因组 DNA（不同样品尤 其疾病样品中中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异 也可能非常大）。 4． 本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理 的全血量（20µl-10ml），请联系我们索取其它处理量的操作手册。 5． 本试剂盒可运用于各种非抗凝剂的全血。 6． 为了最佳效果，最好使用 4℃存放小于 3 天的标本，反复冻融超过 3 次的标本，会严重降低产量。 7． 对于每个样品提取血量大的客户或者用量大的客户，可以和我们联 系，我们另有专门准备有优惠的大包装试剂。 五、操作步骤 1．取解冻后含血凝块的全血 2ml（或 2g）至离心柱中，5,000rpm 离心 10 分钟，收集下液。 2． 吸取 6--8ml 红细胞裂解液到步骤 1 所得的下液中，用枪吹打混匀后 转入 10ml 的离心管中，盖紧管盖，Vortex 2-3 分钟， 3．室温放置 10 分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次或者摇床上面轻摇帮 助裂解红细胞），血块完全溶解。 4．5,000rpm 离心 10 分钟，弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清 （注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约 100μl 的残留上清。 离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团 在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分， 应该再加入适量红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤 3，4。 5. 涡旋振荡 25 秒重悬白细胞团，充分分散白细胞团。 6． 加入 2--3ml 细胞核裂解液到重悬的白细胞中，再加入 20ul 蛋白酶 K （20mg/ml）,适度吹打几次混匀，以裂解白细胞，由于有部分基因 组 DNA 释放出来，这个时候混合物会变得十分粘稠，立刻停止吹 打（以免剪切断基因组 DNA），在 60℃温育 3-4 小时（或 55℃过夜 消化）至裂解完全，期间轻微颠倒混匀数次。若还没有裂解，可直 接离心取上清。注:(由于提取的血样样品有差异，所以可以做两手准备， 一种是加蛋白酶 K 的消化，一种是不加蛋白酶 K 的消化，如果结果差别不大， 从节约试验耗材来看，还是不加蛋白酶 K 的更划算。) 7．恢复室温后加入 1.5ml 蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀 20-25 秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。 由于样品体积重量小，用涡旋振荡器振荡混匀产生的剪切力并不会剪切打断基 因组 DNA，如果用手振荡混匀，则不可以用手上下剧烈振荡混匀，只能适当力 度振荡混匀，否则会剪断基因组 DNA，但是力度也不能小,要保证充分混匀，将 粘稠的裂解物打散开，否则 DNA 无法和蛋白质沉淀分离开， 离心的时候会和 蛋白质一起沉淀下来，造成 DNA 丢失或者降低产量。此外混匀不充分也可能造 成蛋白沉淀不充分, 最后的产物污染有较多量的蛋白质。因此建议新手还是用涡 旋振荡器混匀。 8．5,000rpm (可根据离心效果(沉淀如果不紧)调整加大离心力)离心 10 分钟。这时候应该可以见到管底暗褐色的蛋白沉淀，也可能见到一些 蛋白沉淀漂浮在液体表面。 9．小心吸取上清（大约 3.5ml）到一个新的 10ml 离心管中。 吸取上清时小心不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀，如果不小心将 蛋白沉淀转入新的离心管中，可再次离心 2 分钟后取上清。 10．加入等体积的室温异丙醇（约 3.5ml），轻柔颠倒 30 次混匀或者直到 出现棉絮状（丝状）白色 DNA 沉淀。 注意有时候棉絮状（丝状）DNA 沉淀颠倒混匀的时候，粘附着在盖子或者管口 处，即使颠倒也不跟下来，或者附着有气泡导致漂浮在液面，这样导致操作者 看不到沉淀，误认为没有得到 DNA。解决办法是略去步骤 11，直接 5，000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，然后接步骤 13。 11．垂直放置离心管，让白色 DNA 沉淀自然沉到管底，然后尽可能多的 吸弃大部分的上清，注意不要吸到沉淀。 12．加入 3ml70％乙醇后，颠倒混匀，5,000rpm 离心 5 分钟，在管底可 以见到白色的 DNA 沉淀块，倒弃上清。 13．加入 3ml70％乙醇，颠倒几次漂洗 DNA 沉淀，5,000rpm 离心 5 分钟, 倒去上清（沉淀很松，注意不要把 DNA 沉淀倒掉了），倒置后在吸 水纸上轻敲几下以控干残留乙醇，还可以用枪头小心吸掉管底沉淀 周围和管壁的残留乙醇，空气晾干沉淀几分钟。 注意不要干燥过头，否则 DNA 极其难溶，也不能残留太多乙醇，否则乙醇可能 抑制下游如酶切反应。 14．加入 250μlDNA（或者根据浓度需要调整用量）溶解液重新水化溶 解 DNA 沉淀，轻弹管壁混匀，可以放置在 65℃温育 30-60 分钟（不 要超过一小时），也可以在室温或者 4℃放置过夜来重新水化 DNA， 中间不时的轻弹管壁帮助重新水化 DNA。 15. DNA 可以存放在 2-8℃,如果要长时间存放，可以放置在-20℃。 六、疑难解答（Trouble shooting） 见下页表格 出现的问题 可能的原因 建议解决方法 标本中含有血凝块 不恰当的存放标本，未充 分混匀，未使用合适的抗 凝收集管 丢弃有血凝块的标本，重新用 EDTA,肝素，柠檬酸抗凝管收集血 液。 红细胞裂解不完全 血液标本裂解前没有回复 到室温 处理前先把血液标本回复到室 温。 裂解时间不够 可延长裂解时间至 15 分钟以上。 裂解过程中没有多次混匀 裂解过程中可以更多次颠倒混 匀，或者轻弹管壁帮助裂解。 DNA产量低 血液标本中本身含有的白 细胞数量低 增加起始血液处理量 白细胞裂解不完全 仔细阅读步骤 6 的操作要领。加 入裂解液之前，必须剧烈涡旋振 荡打散重悬白细胞沉淀团块，否 则很难裂解完全。如果是肝素抗 凝的血样，白细胞团块很难打散， 加入裂解液后应该在 65℃温育帮 助裂解直到看不见细胞团块。白 细胞数量太大超出裂解能力，适 当增加细胞核裂解液体积。 血液标本存放时间太长 存放在4℃的血液标本超过5天的 产量可能大大降低，因此不要存 放太久。 DNA 沉淀在洗涤的时候 丢失了 异丙醇沉淀后用乙醇洗涤的过程 中，倒弃上清的时候要格外小心， 不要把 DNA 沉淀也倒掉了。 接前表 出现的问题 可能的原因 建议解决方法 DNA长度小于30kb 血液样品太老或者不正确 的存放，造成 DNA 降解 选用新鲜的血液样品。 操作不当，造成对基因组 DNA 的剪切 混匀轻柔，不可以用手剧烈振荡离心 管，选用大口径的枪头转移或者混匀 DNA。 未见到蛋白沉淀 加入蛋白沉淀液前，裂解 混合物没有冷却回室温 冷却至室温或者冰上放置 5 分钟后 再加入蛋白沉淀液。 蛋白沉淀液没有和裂解混 合物充分混匀 应该连续高速涡旋振荡混匀 25 秒， 涡旋并不会剪切断 DNA。 A260/A280 <1.6 污染有蛋白质 看看上述“未见到蛋白沉淀”问题的 解决方法，确保蛋白通过沉淀去除。 另外请参见步骤 9，防止蛋白污染。 测定吸光值时用水稀释 DNA 会降低 A260/A280 使用TE缓冲液来稀释DNA,保证PH 值大于 8.0。 DNA沉淀难以重新 溶解水化 晾干 DNA 沉淀时过度了 晾干时候密切观察，不要干燥过头， 注意应该观察管底的 DNA 沉淀，有 时候管壁上的残留乙醇已经挥发，但 留下一些水分还没有干，只要管底 DNA 干了就可以加入 DNA 溶解 液。可在 65℃温育帮助重新溶解（不 要超过一小时）然后室温或者 4℃放 置过夜，期间可以颠倒轻弹帮助溶 解。 下游酶切切不开 DNA 未干燥完全，残留乙 醇太多 敞开离心管口，在 65℃温育几分钟， 让乙醇挥发