NMY51 Chemically Competent Cell 产品说明书

NMY51:                                                           10×100μl              保存条件：- 80℃

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                        10μl              保存条件：- 80℃

Carrier DNA (5 μg/μl)                                           100μl              保存条件：-20℃

PEG/LiAC:                                                                 5ml              保存条件：  4℃

产品说明

DUAL membrane系统是DUAL systems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术，它利用分离的泛素系统 (split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株Transformation marker为：trp1，leu2-3，报告基因为：HIS3，ADE2和 lacZ，第一步通过营养缺陷型报告基因 (HIS3，ADE2)进行选择性生长筛选，进一步通过 LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。原理：泛素 (ubiquitin)分子量很小，由 76 aa残基组成；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的 N端，然后被泛素专一性蛋白酶 (UBPs)识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分：N端 (Nub)，C端 (Cub)。首先，人为地将泛素 Nub的 3位异亮氨酸突变为甘氨酸 (NubI 突变为 NubG)。这样与 Cub的亲合力大大降低，避免了 Cub和 Nub自我结合或接近的可能性。其次，将Cub部分与人工合成的 LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合，UBPs也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成 bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白 (prey-NubG)。如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 NubG和 Cub的相互接近，被 UBPs识别，导致 LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。 此系统可使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志均为LEU；三种Prey质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为TRP。NMY51感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>10⁴cfu/μg DNA。

1. 取100 µl冰上融化的NMY51感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100度5min,快速冰浴，重复一次）10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀，30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3. 5000 rpm离心 40s弃上清，ddH₂O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。

4. ddH₂O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. NMY51酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培养可见直径1 mm克隆。