总结了细菌、真菌 DNA 的提取方法

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总结了细菌、真菌 DNA 的提取方法

细菌 DNA 的提取：
方法一：
试剂：
1. 抽提缓冲液
2% CTAB (W/V)、2% PVP K25 (w/v)（去色素）、100 mM Tris-HCl (pH8.0)、25 mM EDTA (pH8.0)、2.0M NaCl
2.10M LiCl
3. 2M LiCl
4.DEPC-water（抑制 RNA 酶活性）
5. 3M NaAc (pH5.2)
6. 96% 乙醇
7. 70% 乙醇
步骤：
1. 抽提缓冲液 65℃ 预热；
2. 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10 min；
3. 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心 12,000rpm，10 min；
4. 取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心 12,000rpm，10 min；
5. 取上清，重复 4 步骤；
6. 加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠和 1.5 倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C 沉淀；
11. 离心 12,000rpm，10 min；
12. 弃上清，70％乙醇洗，也可以再用 100％乙醇洗，然后溶解于 100 ml 水中。
方法二：
注意：我们常用的方法，但是有时有些细菌特别不好提，就用上面的方法。
1. 将菌株接种于液体 LB 培养基，37℃ 震荡培养过夜。
2. 取 1.5 ml 培养物 12000rpm 离心 2 min。
3. 沉淀物加入 567 ul 的 TE 缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入 30ul 10%SDS 和 15ul 的蛋白酶 K，混匀，于 37℃ 温育 1 h.
4. 加入 100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入 80ul CTAB/NaCl 溶液，混匀后再 65℃ 温育 10 min。
5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心 4-5 min, 将上清转入一只新管中，加入 0.6-0.8 倍体积的异丙醇，轻轻混合直到 DNA 沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6. 沉淀用 1 ml 的 70% 乙醇洗涤后，离心弃乙醇．
真菌 DNA 的提取：
方法一：
1. 取真菌菌丝 0.5 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2. 加入 4 mL 提取液，快速振荡混匀
3. 加入等体积的 4 mL 的氯仿: 异戊醇 (24:1)，涡旋 3～5 min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）
4.1000rpm，4℃，5 min
5. 上清用体积的氯仿: 异戊醇 (24:1) 再抽提一次（10,000 rpm，4℃ 离心 5 min）
6. 取上清，加入 2/3 倍体积的-20℃ 预冷异丙醇或 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约 30 min
7. 用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用 75% 乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗 1 次, 吹干，重悬于 500 mulTE 中
8. 加入 1 ul RNaseA（10 mg/mL），37℃ 处理 1 hr
9. 用酚（pH8.0）: 氯仿: 异戊醇 (25:24:1) 和氯仿: 异戊醇 (24:1) 各抽提 1 次（10,000 rpm，4℃ 离心 5 min）
10. 取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V 体积的无水乙醇, -70℃ 沉淀 30 min 以上
11. 沉淀用 75% 乙醇漂洗，风干, 溶于 200 ulTE 中，-20 ℃ 保存备用
12. DNA 提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS，
3M NaAc
方法二：
1. 真菌菌丝 0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2. 加入 3 mL 65℃ 预热的 DNA 提取缓冲液，快速振荡混匀 65℃ 水浴 30 min, 期间混匀 2-3 次
3．加入 1 mL 5M KAc，冰浴 20 min
4．等体积的氯仿: 异戊醇 (24:1) 抽提 1 次（10,000 rpm，4℃ 离心 5 min）
5．取上清，加入 2/3 倍体积的-20℃ 预冷异丙醇, 混匀, 静置约 30 min
6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用 75% 乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗 1 次, 吹干，重悬于 500 mL TE 中
7．加入 1 ul RNaseA（10 mg/mL），37℃ 处理 1 hr
8．用酚（pH8.0）: 氯仿: 异戊醇 (25:24:1) 和氯仿: 异戊醇 (24:1) 各抽提 1 次（10,000 rpm，4℃ 离心 5 min）
9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V 体积的无水乙醇, -70℃ 沉淀 30 min 以上
10．沉淀用 75% 乙醇漂洗，风干, 溶于 200 ul TE 中，-20 ℃ 保存备用。
以上就是一些实验室常用的方法