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蛋白样品提取是蛋白定量和分析的基础。天然蛋白质分子结构、化学性能各异,选择适当的细胞裂解液制备蛋白样品至关重要。GenStar®提供了多种不同配方的蛋白质裂解液,以适应不同样品和不同用途的需要。选择细胞裂解液时,除了要考虑蛋白产量,还要考虑所选择的一抗的是否能识别线性的抗原表位。一些含有十二烷基硫酸钠(SDS)和强离子去污剂(如脱氧胆酸钠等)的蛋白质裂解液能够从组织或细胞中提取出大量的蛋白质,适用于PAGE,Western blot等检测;但由于这类裂解液易使蛋白变性,因而不适于免疫共沉淀(Co-IP)等实验。当使用某些只能识别非变性的抗原表位的抗体时,应该选择不含去垢剂或含有较温和的非离子去污剂(如NP-40,Triton X-100等)的裂解液,而不能使用含有SDS和强离子去垢剂的蛋白质裂解液。
蛋白浓度测定
确定蛋白样品浓度对许多实验都是至关重要的。通常大多数蛋白样品的浓度可以通过比色测定法定量。根据一些特殊化学试剂与蛋白质结合发生颜色变化的原理,使用分光光度计或酶标仪检测特定波长下的吸光值,通过与蛋白标准品进行比较,可以换算出样品中的蛋白含量。GenStar公司提供两种蛋白定量试剂,均可用于96孔板、比色杯或试管法测定吸光值。Bradford蛋白质定量试剂(Cat. No. E161-01)具有灵敏度高、简便快速、价格低廉的特点;BCA蛋白质定量试剂(Cat. No. E162-01)可提供更高的灵敏度和准确性,而且不受去垢剂的影响,更适宜微量蛋白的测定。
蛋白质电泳和Western blot
蛋白质电泳是分离、鉴定蛋白质分子量和浓度的重要方法,尤其是聚丙烯酰胺凝胶电泳(Po lyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE)。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺可聚合形成具有分子筛效应的网状结构聚合物,作为电泳时的固相支持物。进行非变性PAGE(Native PAGE)时,蛋白质在电泳过程中保持完整的状态,并依三种因素分开:分子量大小、形状和所带电荷。变性PAGE(SDS-PAGE)中,添加了作为变性剂和助溶剂的阴离子去垢剂SDS。SDS一方面可以打开蛋白质分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,消除蛋白质间形状上的差异;另一方面可以和解聚后的氨基酸侧链按比例结合,使得蛋白质-SDS复合物所带的负电荷大大超过蛋白质本身的电荷量,消除了蛋白质间的电荷差异。因此,在SDS-PAGE中,蛋白质在电场下的迁移速率只和其分子量大小相关。
不同浓度Tris-Glycine凝胶的最佳线性分离范围
免疫印迹法(Western blot)是鉴定蛋白质和多肽,以及检测蛋白表达水平常用的手段。该技术通常是将经过PAGE分离的蛋白质或多肽分子转移到固相载体(PVDF膜或硝酸纤维素膜)上,通过目标蛋白的特异性抗体(一抗)进行免疫反应,再与酶标记的第二抗体(二抗)反应,经过底物显色或发光,从而检测到特异性目的蛋白。
GenStar提供蛋白电泳和Western blot检测所需的全套试剂,产品稳定可靠,节省您自行配制试剂的时间,确保实验前后结果的一致性。EasyPAGE Kit(Cat. No. E158, E159)为国内独创的快速蛋白凝胶制备试剂盒,提供四种不同浓度的预混SDS-PAGE制胶溶液。使用时只需要简单混合,既节约了时间,又减少了与有毒物质的接触机会,安全健康。Direct-load™ Protein Markers分为预染和非预染两类,涵盖不同的分子量范围,供用户灵活选择。StarSignal Chemiluminescent Assay Kit(Cat.No. E171)采用新型的发光底物增强剂,检测灵敏度比普通ECL试剂高数百倍,大大节省抗体用量,发光稳定性是SuperSignal West Pico的5倍左右,使检测的有效时间延长至数小时。