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实时定量PCR操作步骤, 方法,技巧,注意事项
一 ：引物的设计
引物的设计对于这个实验至关重要，因为 real time pcr 的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：
1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是 SYBR 照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。
2，引物的特异性一定要高（不像常规 PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。real time PCR 只有在熔解曲线的时候能分开，所以这就造成整个实验结果误差很大，不可信）。
3，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以 cDNA 为模板来扩增的，如果有 DNA 污染的话，因为 DNA 上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。
4，引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度，方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大，就得分开做，浪费模板，浪费管家基因，所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致，这样就不用每次查退火温度，且对整个实验有利。
5，注意引物设计好后的产物长度。REAL TIME PCR 的最佳产物长度在 150-250kb 左右（书上说这样可以增加荧光的敏感度，减少实验误差，但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大，SYBR 嵌入的越多，这样才能够保证最后的荧光值比较可信）。
6，不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大，就不能使用 delt，deltCt 法来比较基因表达量的高低。
二： 模板的要求
归根到底，REAL TIME pcr 想要检测的是目的基因表达量的高低，所以对整个实验过程中模板的质量要求必然很高，我以自己的一些经验说一下操作过程中的一些关键点：
1，用 TRIZOL 提取 RNA 有范围要求。细胞数必须在一个范围之内才能提取出高质量的 RNA，所以我们在提取前必须知道细胞数（一般 6 孔板中两个孔就可以提取出 RNA）。
2，加入氯仿抽提过程中尽可能不要吸到中间层（中间层为基因组 DNA，对上机做 REAL TIME PCR 很不利，会导致起始荧光值很高，无法跑出完整的扩增曲线）。
3，提取完后用乙醇溶解要尽可能使得乙醇挥发掉，但是不要过分挥发。
注意：乙醇没有挥发干净会对后续的扩增效率有影响。在乙醇存在的情况下，DNA 更加难溶，这就是醇沉的道理。但是过分挥发，RNA 又不溶于水，会造成后续反转录量不高。
4，反转录过程的操作尽可能在冰上。
我们用的是 OLIGO DT18，为了尽可能的消除 RNA 之间的二聚体，我们将 RNA 和 OLIGO DT18 在一起 70 度变性 10 分钟后，马上冰浴 2 分钟，再加入后续的 MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在 37-40 度下一个小时完成延伸过程。
注意：也有的步骤上将 RNA 先 70 度变性 10 分钟，再加入 OLIGO DT18 和 MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在变性完再加 OLIGO DT18 时，加的比较晚的管子有很大的可能 RNA 又重新形成二聚体，导致前面的变性没有意义。
5，反转录完后将 cDNA -20 度保存，尽可能不要反复冻融（可以以 10UL 为一个单位来分装 cDNA）。
6，在加样的过程中需要特别注意：
（1）最好引物和水做 MIX, 且配置完后需要放置在冰上，这样可以消除不同管之间引物浓度的差异。
（2）最后加模板的时候需要一把很准确的移液器，以便确保每次加进去的样一致，注意不要沾管壁。有条件的话可以加 ROX, 来消除不同的加样体系来造成的误差。
大部分人说需要混匀，但是我认为只要确保加入到体系中就可以，不用刻意混匀。因为我们在反应前有个 95 度变性，大家可以想象一下，在 95 度时候体系内的分子运动是很剧烈的，完全可以混匀。
（3）加样完毕后最好离心一下，防止沾璧。
三： 上机操作
在做整个实验之前，应该对实验有个整体的计划，每个管中所加的物质要有计划。在程序上编好号码，选好需要进行的熔解曲线（因为机器刚开始是默认为不进行熔解曲线，切记）。
扩增时，可以选择两步法（产物长度较小，退火和延伸都在 60 度完成），也可以选择三步法（产物较大，只能分为 3 步，且应该根据产物的长度来确定延伸时间，因为 TAQ 酶的延伸速度最少也在 50BP/S，因此可以换算出所需要的延伸时间）。
扩增完毕后进行熔解曲线，这个是必须要有的，因为这样才能鉴定你产物的特异性和有无引物二聚体。如果前几次做的话最好在做完 REAL TIME PCR 后将产物在 1% 的琼脂糖凝胶上电泳，来确定自己的判断。
四： 分析数据
用的比较多的是用双 DELT 法相对定量，而绝对定量则必须要进行标准曲线的制备，需要对这个基因构建质粒，克隆分离。所以我们对基因表达量高低用双 DELT 法（前提是扩增效率要一致）。熔解曲线观察，如果同一基因的熔解曲线不一样，则造成结果不一致，重复性很差，因此要多摸条件，尽可能使熔解曲线一致。
实验步骤：
1. 设计引物，溶解成为 10 mM 的浓度。
2. 提取 RNA，反转录成 CNDA
3. 常规 PCR 以实验所得模板扩增看家基因 40 个循环，电泳看产物多少。如果少，则不能进行 REAL TIME PCR 操作。
4. 编写好程序，加样，上机
5. 分析结果
引物的设计对于这个实验至关重要，因为 real time pcr 的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：
1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是 SYBR 照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。
2，引物的特异性一定要高（不像常规 PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。real time PCR 只有在熔解曲线的时候能分开，所以这就造成整个实验结果误差很大，不可信）。
3，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以 cDNA 为模板来扩增的，如果有 DNA 污染的话，因为 DNA 上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。
4，引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度，方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大，就得分开做，浪费模板，浪费管家基因，所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致，这样就不用每次查退火温度，且对整个实验有利。
5，注意引物设计好后的产物长度。REAL TIME PCR 的最佳产物长度在 150-250kb 左右（书上说这样可以增加荧光的敏感度，减少实验误差，但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大，SYBR 嵌入的越多，这样才能够保证最后的荧光值比较可信）。
6，不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大，就不能使用 delt，deltCt 法来比较基因表达量的高低。
二： 模板的要求
归根到底，REAL TIME pcr 想要检测的是目的基因表达量的高低，所以对整个实验过程中模板的质量要求必然很高，我以自己的一些经验说一下操作过程中的一些关键点：
1，用 TRIZOL 提取 RNA 有范围要求。细胞数必须在一个范围之内才能提取出高质量的 RNA，所以我们在提取前必须知道细胞数（一般 6 孔板中两个孔就可以提取出 RNA）。
2，加入氯仿抽提过程中尽可能不要吸到中间层（中间层为基因组 DNA，对上机做 REAL TIME PCR 很不利，会导致起始荧光值很高，无法跑出完整的扩增曲线）。
3，提取完后用乙醇溶解要尽可能使得乙醇挥发掉，但是不要过分挥发。
注意：乙醇没有挥发干净会对后续的扩增效率有影响。在乙醇存在的情况下，DNA 更加难溶，这就是醇沉的道理。但是过分挥发，RNA 又不溶于水，会造成后续反转录量不高。
4，反转录过程的操作尽可能在冰上。
我们用的是 OLIGO DT18，为了尽可能的消除 RNA 之间的二聚体，我们将 RNA 和 OLIGO DT18 在一起 70 度变性 10 分钟后，马上冰浴 2 分钟，再加入后续的 MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在 37-40 度下一个小时完成延伸过程。
注意：也有的步骤上将 RNA 先 70 度变性 10 分钟，再加入 OLIGO DT18 和 MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在变性完再加 OLIGO DT18 时，加的比较晚的管子有很大的可能 RNA 又重新形成二聚体，导致前面的变性没有意义。
5，反转录完后将 cDNA -20 度保存，尽可能不要反复冻融（可以以 10UL 为一个单位来分装 cDNA）。
6，在加样的过程中需要特别注意：
（1）最好引物和水做 MIX, 且配置完后需要放置在冰上，这样可以消除不同管之间引物浓度的差异。
（2）最后加模板的时候需要一把很准确的移液器，以便确保每次加进去的样一致，注意不要沾管壁。有条件的话可以加 ROX, 来消除不同的加样体系来造成的误差。
大部分人说需要混匀，但是我认为只要确保加入到体系中就可以，不用刻意混匀。因为我们在反应前有个 95 度变性，大家可以想象一下，在 95 度时候体系内的分子运动是很剧烈的，完全可以混匀。
（3）加样完毕后最好离心一下，防止沾璧。
三： 上机操作
在做整个实验之前，应该对实验有个整体的计划，每个管中所加的物质要有计划。在程序上编好号码，选好需要进行的熔解曲线（因为机器刚开始是默认为不进行熔解曲线，切记）。
扩增时，可以选择两步法（产物长度较小，退火和延伸都在 60 度完成），也可以选择三步法（产物较大，只能分为 3 步，且应该根据产物的长度来确定延伸时间，因为 TAQ 酶的延伸速度最少也在 50BP/S，因此可以换算出所需要的延伸时间）。
扩增完毕后进行熔解曲线，这个是必须要有的，因为这样才能鉴定你产物的特异性和有无引物二聚体。如果前几次做的话最好在做完 REAL TIME PCR 后将产物在 1% 的琼脂糖凝胶上电泳，来确定自己的判断。
四： 分析数据
用的比较多的是用双 DELT 法相对定量，而绝对定量则必须要进行标准曲线的制备，需要对这个基因构建质粒，克隆分离。所以我们对基因表达量高低用双 DELT 法（前提是扩增效率要一致）。熔解曲线观察，如果同一基因的熔解曲线不一样，则造成结果不一致，重复性很差，因此要多摸条件，尽可能使熔解曲线一致。
实验步骤：
1. 设计引物，溶解成为 10 mM 的浓度。
2. 提取 RNA，反转录成 CNDA
3. 常规 PCR 以实验所得模板扩增看家基因 40 个循环，电泳看产物多少。如果少，则不能进行 REAL TIME PCR 操作。
4. 编写好程序，加样，上机
5. 分析结果